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Na última década os ensaios de hibridação in situ fluorescente (FISH) baseados em mímicos de ácidos nucleicos, especialmente o acido péptido nucleico (FISH PNA), têm sido muito explorados para a identificação de agentes patogénicos clínicos. Vários estudos têm demonstrado que a sua implementação como um método de rotina em laboratórios clínicos permite o uso racional de medicamentos, reduz o tempo de internamento e a mortalidade [1-4]. Outra vantagem importante é a capacidade de detetar resistências a antibióticos resultantes de mutações pontuais no RNA ribossomal. Estas mutações pontuais têm sido amplamente encontrada em bactérias que apresentam resistência a macrolidos e linezolida [5-7]. O nosso grupo aproveitou esta propriedade para desenvolver um método de PNA FISH que permite detetar estirpes de Helicobacter pylori resistentes à claritromicina [TR1]. Este método de alta precisão esteve na base da criação de uma start-up que recebeu um investimento de 1,5 M¤.
Apesar do sucesso do método na deteção de mutações pontuais, existe ainda uma lacuna na deteção de outros mecanismos de resistência associados à presença de genes de cópia única (ou baixo número de cópias) presentes no cromossoma ou plasmídeos bacterianos [8, 9]. O sinal de FISH é o resultado de centenas/milhares de sondas ligadas às cópias de rRNA presentes em cada célula.
Contudo, numa hibridação dirigida ao genoma existe apenas um complexo sonda-alvo, o que é insuficiente para emitir um sinal fluorescente detetável. Uma outra desvantagem da técnica de FISH é o baixo número de alvos distinguíveis, geralmente limitado a 2 ou 3 - uma limitação relacionada com o número de fluorocromos que podem ser discriminados.
Para ultrapassar estas limitações, duas novas variações de FISH foram desenvolvidas para permitir (i) a deteção de vários alvos simultaneamente, ou (ii) a deteção de genes de cópia única. A primeira (CLASI-FISH) tira partido da marcação fluorescente combinatória para criar um código de cor pa  |
Resumo
Na última década os ensaios de hibridação in situ fluorescente (FISH) baseados em mímicos de ácidos nucleicos, especialmente o acido péptido nucleico (FISH PNA), têm sido muito explorados para a identificação de agentes patogénicos clínicos. Vários estudos têm demonstrado que a sua implementação como um método de rotina em laboratórios clínicos permite o uso racional de medicamentos, reduz o tempo de internamento e a mortalidade [1-4]. Outra vantagem importante é a capacidade de detetar resistências a antibióticos resultantes de mutações pontuais no RNA ribossomal. Estas mutações pontuais têm sido amplamente encontrada em bactérias que apresentam resistência a macrolidos e linezolida [5-7]. O nosso grupo aproveitou esta propriedade para desenvolver um método de PNA FISH que permite detetar estirpes de Helicobacter pylori resistentes à claritromicina [TR1]. Este método de alta precisão esteve na base da criação de uma start-up que recebeu um investimento de 1,5 M¤.
Apesar do sucesso do método na deteção de mutações pontuais, existe ainda uma lacuna na deteção de outros mecanismos de resistência associados à presença de genes de cópia única (ou baixo número de cópias) presentes no cromossoma ou plasmídeos bacterianos [8, 9]. O sinal de FISH é o resultado de centenas/milhares de sondas ligadas às cópias de rRNA presentes em cada célula.
Contudo, numa hibridação dirigida ao genoma existe apenas um complexo sonda-alvo, o que é insuficiente para emitir um sinal fluorescente detetável. Uma outra desvantagem da técnica de FISH é o baixo número de alvos distinguíveis, geralmente limitado a 2 ou 3 - uma limitação relacionada com o número de fluorocromos que podem ser discriminados.
Para ultrapassar estas limitações, duas novas variações de FISH foram desenvolvidas para permitir (i) a deteção de vários alvos simultaneamente, ou (ii) a deteção de genes de cópia única. A primeira (CLASI-FISH) tira partido da marcação fluorescente combinatória para criar um código de cor para cada característica [10] [TR2]; enquanto a segunda (RING-FISH) faz uso de sondas polirribonucleicas para permitir a deteção especifica de fragmentos do genoma bacteriano [11, 12]. No entanto, não existe qualquer técnica que combine estas diferentes vantagens. Além disso, estas técnicas de FISH sofrem de limitações associadas ao uso de sondas de DNA, tais como a baixa afinidade e longos passos de hibridação, que geralmente comprometem a robustez do processo e impedem uma aplicação mais ampla [13, 14]. A adaptação destas tecnologias aos novos mímicos de ácidos nucleicos, que têm uma maior afinidade para o alvo, pode ser realizada de forma a criar um processo mais rápido, robusto e simples. |
