Manipulação Molecular e Biotecnologia

Código:

B301

Sigla:

B301

Áreas Científicas
Classificação	Área Científica
OFICIAL	Biologia

Ocorrência: 2011/2012 - 1S

Ativa?	Sim
Página Web:	http://elearning2.fc.up.pt/aulasweb0910/course/view.php?id=2656
Unidade Responsável:	Departamento de Biologia
Curso/CE Responsável:	Licenciatura em Biologia

Ciclos de Estudo/Cursos

Sigla	Nº de Estudantes	Plano de Estudos	Anos Curriculares	Créditos UCN	Créditos ECTS	Horas de Contacto	Horas Totais
L:B	111	Plano de estudos a partir de 2008	3	-	7,5	70	202,5
L:CC	6	Plano de estudos de 2008 até 2013/14	3	-	7,5	70	202,5
L:F	1	Plano de estudos a partir de 2008	2	-	7,5	70	202,5
			3
L:G	0	P.E - estudantes com 1ª matricula anterior a 09/10	3	-	7,5	70	202,5
		P.E - estudantes com 1ª matricula em 09/10	3	-	7,5	70	202,5
L:M	0	Plano de estudos a partir de 2009	3	-	7,5	70	202,5
L:Q	29	Plano de estudos Oficial	3	-	7,5	70	202,5

Língua de trabalho

Português

Objetivos

Fornecer conceitos básicos e avançados sobre manipulação de DNA, tecnologias de DNA recombinante, clonagem e suas aplicações na transformação genética de organismos e na análise de genomas e da expressão genética.
Conhecimento das técnicas actualmente utilizadas de forma transversal em diversas áreas de investigação e desenvolvimento em Biologia Moderna (Biologia Forense, Evolução e Filogenia, entre outras), Ciências Biomédicas, Biotecnologia, farmacogenómica e diagnóstico.
Familiarização com análise de artigos científicos originais, lógica do desenho experimental e análise de dados

Programa

Passos históricos na tecnologia de DNA recombinante. Enzimas de restrição. Descoberta e funções fisiológicas do sistema restrição/modificação das bactérias e archaea. Mecanismo de actividade, diversidade, e propriedades notáveis das enzimas de restrição. Endonucleases de tipo I, II e III. Mapas de restrição. Construção de um mapa de restrição. Exigências específicas práticas de enzimas de restrição.
Clonagem de DNA. A reacção catalisada pela DNA ligase. Plasmídeos e outros vectores de clonagem. Antibióticos como marcadores de selecção. Clonagem direccional. Clonagem direccional com extremidades compatíveis. Clonagem TA. Clonagem com extremidades em cadeia dupla. O plasmídeo pBR322, plasmídeos pUC: alfa-complementação e inactivação por inserção. Selecção positiva de recombinantes usando o gene citotóxico ccdB. Validação de recombinantes por análise de restrição, por PCR e por sequenciação. Topologia dos plasmídeos, e respectivas propriedades de migração em gel de agarose. Sistemas de clonagem baseados nas DNA topoisomerases. Sistemas de clonagem baseados em recombinases. Sistema de recombinação sítio-específica derivada do bacteriófago lambda (o sistema Gateway). Vectores de expressão. Promotor lacP. Vectores de expressão baseados no sistema de RNA polimerases de origem fágica e genes fágicos tardios. Vectores de expressão eucariótica. Sistemas repórter.
A reacção da polimerase em cadeia (PCR). Marcos científicos que contribuíram para o advento da PCR. Componentes necessários da PCR. Optimização da PCR. Parâmetros determinantes para a escolha dos oligonucleótidos iniciadores. Variantes e aplicações especiais da PCR. RT-PCR (transcriptase reversa-PCR) e respectivas aplicações no estudo da expressão de genes. Estratégias para completar cDNAs: 5' e 3'-RACE. PCR com primers degenerados. PCR multiplex. PCR 'nested'. PCR invertido (IPCR). PCR de sobreposição e mutagénese sítio-específica. PCR em tempo real (qPCR). Diferentes sistemas químicos usados no qPCR. Potencialidades quantitativas do qPCR.
Detecção de clones de interesse por hibridação de DNA. Tipos de sondas. Sondas degeneradas. Condições de hibridação de DNA. Restringência e especificidade. Condições que afectam a restringência. Temperatura de desnaturação, Tm. Estimativa de Tm e parâmetros de que depende. Detecção de DNA e mRNA específicos: 'Southern blotting' e 'Northern blotting'. Aplicações da técnica de 'Southern blotting'.
“DNA microarrays”. Técnica e aplicações.Sequenciação de DNA. Método químico de Maxam-Gilbert e método enzimático de Sanger. Sequenciação manual e automática. “Cycle sequencing”. Pirosequenciação.


Aulas práticas
Introdução às técnicas básicas de Biologia Molecular: micropipetagem, cuidados para evitar a contaminação por Dnases, utilização de culturas bacterianas, cuidados com a manipulação de brometo de etídio, manipulação de enzimas de restrição.
-Obtenção de células de Escherichia coli competentes para transformação
-Transformação genética de E. coli com DNA plasmídico por choque térmico
- Análise dos resultados: cálculo da eficiência de transformação; selecção de transformantes; selecção dos recombinantes.
- Análise de características genéticas dos vectores e das estirpes utilizadas.
-Purificação e análise de DNA plasmídico:
-Quantificação de DNA plasmídico por espectrofotometria e comparação visual
-análise por electroforese em gel de agarose
-Análise de mapas de restrição
- PCR: desenho de primers, amplificação de sequências de interesse. “Colony PCR”

Bibliografia Obrigatória

Micklos DA, Freyer GA ; DNA Science: A First Course
Sambrook J, Russell D ; Molecular Cloning, a laboratory manual
Videira, A ; Engenharia genética – Princípios e aplicações
Watson, J. D., Caudy, A. A., Myers, R. M. & Witkowski, J. A; ) Recombinant DNA. Genes and genomes: a short course

Métodos de ensino e atividades de aprendizagem

Aulas expositivas com recurso a slides e animações educativas. Discussão de artigos e resolução de exercícios. As actividades incluem palestras, grupos de discussão, tutoriais, solução de problemas, debates, etc. Resolução de exercícios na plataforma de E-Learning.

Software

pDRAW32
Primer3

Tipo de avaliação

Avaliação distribuída com exame final

Obtenção de frequência

Frequência obrigatória às aulas práticas – mínimo 2/3
Entrega de trabalhos obrigatórios das aulas práticas: a não entrega desconta na nota TP até 2 valores
Estudantes trabalhadores: obrigatoriedade de entrega dos trabalhos para obtenção de frequência

Problemas colocados na plataforma de E-Learning

Trabalhos/Apresentações e/ou relatório sobre temas técnicos – 2 valores no exame TP

Fórmula de cálculo da classificação final

Exame Final: (2XT+TP)/3 – mínimo 8 valores em cada componente
Classificações superiores a 19 valores requerem prova oral

Bónus de assiduidade e concretização de exercícios, nos arredondamentos finais até ao máximo de 0,3 valores
Trabalhos/Apresentações e/ou relatório sobre temas técnicos – 2 valores no exame TP

Bónus de assiduidade e concretização de exercícios, nos arredondamentos finais até ao máximo de 0,3 valores
Bónus para apresentações facultativas 1/10 da nota T

Discussão de artigos/exercícios nas aulas teóricas

Melhoria de classificação

Melhoria em exame