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A falha no processo reprodutivo e a forma de o prevenir são aspetos a considerar no estudo da reprodução humana. A gametogénese, a implantação embrionária, o desenvolvimento placentário e embrio-fetal são acontecimentos indispensáveis para uma conceção bem-sucedida de um novo ser humano. A reprogramação epigenética, que ocorre durante a ovogénese, é fundamental para o desenvolvimento dos ovócitos, para a manutenção da estabilidade genómica e para o estabelecimento de marcas epigenéticas, tais como a metilação e a hidroximetilação do DNA. As DNA metiltransferases (DNMTs) são responsáveis pela metilação do DNA adicionando um grupo metil ao 5º carbono de uma citosina, o que resulta numa 5-metilcitosina (5mC). Outra modificação química é a hidroximetilação do DNA, que consiste na oxidação de uma 5mC numa 5-hidroximetilcitosina (5hmC) pelas enzimas Ten-eleven-translocation (TET). A qualidade dos ovócitos é um fator determinante para a fertilização e para o desenvolvimento embrionário, uma vez que, o ovócito transporta informação genética e epigenética essencial para o sucesso reprodutivo. A interação entre os ovócitos e as células somáticas adjacentes, as células do cumulus, permite a troca de nutrientes, de moléculas de sinalização e mRNAS através de projeções transzonais e junções gap, contribuindo para a maturação dos ovócitos. Um desenvolvimento normal do ovócito é fundamental para o sucesso reprodutivo, no entanto, outros eventos durante o desenvolvimento embrionário também são fundamentais para uma gravidez bemsucedida.
Aproximadamente de 10% a 15% das gravidezes clinicamente reconhecidas terminam espontaneamente e cerca de 1% a 5% dos casais sofrem abortamentos recorrentes.
A perda de gravidez tem uma etiologia heterogénea, e pode resultar de vários fatores de risco conhecidos, no entanto, aproximadamente 50% destes abortamentos recorrentes têm causa inexplicável e permanecem idiopáticos. Neste sentido, o principal objetivo deste projeto será de avaliar os me  |
Resumo
A falha no processo reprodutivo e a forma de o prevenir são aspetos a considerar no estudo da reprodução humana. A gametogénese, a implantação embrionária, o desenvolvimento placentário e embrio-fetal são acontecimentos indispensáveis para uma conceção bem-sucedida de um novo ser humano. A reprogramação epigenética, que ocorre durante a ovogénese, é fundamental para o desenvolvimento dos ovócitos, para a manutenção da estabilidade genómica e para o estabelecimento de marcas epigenéticas, tais como a metilação e a hidroximetilação do DNA. As DNA metiltransferases (DNMTs) são responsáveis pela metilação do DNA adicionando um grupo metil ao 5º carbono de uma citosina, o que resulta numa 5-metilcitosina (5mC). Outra modificação química é a hidroximetilação do DNA, que consiste na oxidação de uma 5mC numa 5-hidroximetilcitosina (5hmC) pelas enzimas Ten-eleven-translocation (TET). A qualidade dos ovócitos é um fator determinante para a fertilização e para o desenvolvimento embrionário, uma vez que, o ovócito transporta informação genética e epigenética essencial para o sucesso reprodutivo. A interação entre os ovócitos e as células somáticas adjacentes, as células do cumulus, permite a troca de nutrientes, de moléculas de sinalização e mRNAS através de projeções transzonais e junções gap, contribuindo para a maturação dos ovócitos. Um desenvolvimento normal do ovócito é fundamental para o sucesso reprodutivo, no entanto, outros eventos durante o desenvolvimento embrionário também são fundamentais para uma gravidez bemsucedida.
Aproximadamente de 10% a 15% das gravidezes clinicamente reconhecidas terminam espontaneamente e cerca de 1% a 5% dos casais sofrem abortamentos recorrentes.
A perda de gravidez tem uma etiologia heterogénea, e pode resultar de vários fatores de risco conhecidos, no entanto, aproximadamente 50% destes abortamentos recorrentes têm causa inexplicável e permanecem idiopáticos. Neste sentido, o principal objetivo deste projeto será de avaliar os mecanismos genéticos e epigenéticos subjacentes à ovogénese e ao desenvolvimento embrio-fetal de modo a desvendar novas vias moleculares que poderão ajudar a responder a questões importantes da medicina reprodutiva e a melhorar o aconselhamento genético durante a gravidez. Inicialmente, avaliaremos características essenciais associadas à regulação da transcrição e às interações dos ovócitos humanos com as células somáticas circundantes durante a maturação, realizando a análise do transcriptoma (RNA-Seq) nos dois tipos de células. De seguida, a expressão de genes relevantes e
genes reguladores epigenéticos -DNMTs e TETs- será avaliada em mais amostras utilizando o PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Além disso, a expressão destes reguladores epigenéticos será comparada com os níveis globais de 5mC, 5hmC, DNMTs e TETs por um ensaio de imunofluorescência, permitindo uma compreensão mais aprofundada da reprogramação epigenética durante a ovogénese. A possibilidade da utilização das células do cumulus para inferir o transcriptoma dos ovócitos e o seu estado epigenético será também avaliada, possibilitando a identificação de biomarcadores neste tipo de células e o uso dos respetivos ovócitos para tratamentos de infertilidade. Posteriormente, propomos um estudo extensivo do transcriptoma em amostras de placenta de perdas de gravidez idiopáticas ao longo dos três trimestres de gestação, utilizando também RNA-Seq. De seguida, os resultados obtidos por RNA-Seq, serão confirmados por RT-qPCR num maior número de amostras de placenta e serão também analisados os níveis de expressão dos
genes relevantes nos RNAs extraídos dos tecidos fetais correspondentes, por RT-qPCR. Serão ainda analisados os níveis de 5mC e 5hmC nas regiões reguladoras destes genes (por sequenciação bissulfito e sequenciação bissulfito oxidativo) e, consequentemente, serão correlacionados com as variações de expressão que forem observadas. Finalmente, propomos a realização de Drop-Seq (10X Genomics), que irá possibilitar a análise do transcriptoma de apenas uma célula em grande escala, permitindo agrupar diferentes populações celulares e, deste modo, determinar que tipos de células da placenta estão a contribuir para as possíveis alterações observadas na expressão génica. As futuras descobertas deste estudo poderão revelar novas causas subjacentes à perda de gravidez idiopática e poderão contribuir para melhorar o aconselhamento genético oferecido aos casais que sofrem perdas recorrentes de gravidez. Além disso, a possibilidade de criar terapias dirigidas a mecanismos epigenéticos poderá ser tido em conta, tais como o tratamento durante a gravidez com dadores de grupo metil dietéticos, tais como metionina, folato, betaína ou colina. Assim, o estudo dos fatores (epi)genéticos que influenciam o desenvolvimento dos ovócitos e, potencialmente, explicam algumas perdas de gravidez idiopáticas, permitirá o desenvolvimento de novas abordagens para ajudar a alcançar uma gravidez bem-sucedida. |