Patrícia Carla Ribeiro Valentão

Tese de Doutoramento / Title: "Limonete, Hipericão-D-Gerês, Cardo-Do_Coalho, Fel-Da-Terra-Metodologias de Controlo de Qualidade com base na fracção fenólica. Estudos de acção antioxidante e hepatoprotectora"

Resumo / Abstract

Publicações realizadas no âmbito do Doutoramento / Publications related to the study conducing PhD Degree

---

Resumo

Neste trabalho foram estudadas quatro espécies medicinais de grande consumo em Portugal: Lippia citriodora (Limonete), Hypericum androsaemum (Hipericão-do-Gerês), Cynara cardunculus (Cardo-do-Coalho) e Centaurium erythraea (Fel-da-Terra).

Embora a caracterização química do Limonete e do Fel-da-Terra, definida em Farmacopeias, seja feita através da detecção de compostos terpénicos, foi objectivo deste trabalho propor metodologias para controlo de qualidade de cada uma das quatro espécies, baseadas nos seus perfis fenólicos. Cada espécie foi extraída por diversos solventes e os extractos obtidos foram analisados por CLAP acoplado a um detector de díodos. Para estabelecer o perfil fenólico é proposto o extracto que fornece o maior número de compostos identificados.

O extracto etéreo de Limonete é caracterizado pela presença de luteolina, nepetina, hispidulina, jaceosidina, cirsimaritina, cirsilineol e eupatorina. Todas as amostras revelaram um perfil fenólico comum, no qual a hispidulina e a jaceosidina são os compostos maioritários e a nepetina o composto existente em menor quantidade. O extracto metanólico de Hipericão-do-Gerês é caracterizado pela presença dos ácidos 3- e 5-O-cafeoilquínicos, quercetina 3-O-sulfato, quercetina 3-O-galactósido, quercetina 3-O-glucósido, quercetina 3-O-arabinósido, quercetina 3-O-ramnósido, quercetina, kaempferol e de derivados do floroglucinol, que não foram identificados. Contudo, a quantificação dos diversos compostos revelou quatro perfis distintos, facto que pode indicar a existência de diferentes quimiotipos intraespecíficos. O extracto metanólico de Cardo-do-Coalho é caracterizado pela presença dos ácidos 3-, 4, e 5O-cafeoilquínicos, ácido cafeico, ácidos 1,3-, 3,4-, 3,5-, 1,5- e 4,5-O-dicafeoilquínicos, luteolina 7O-glucósido, apigenina 7-O-glucósido e luteolina, sendo os ácidos 5-O-cafeoilquínico e 1,5-O-dicafeoilquínico os compostos mais abundantes. No caso do Fel-da-Terra foi necessário proceder ao isolamento e determinação estrutural dos compostos presentes no extracto clorofórmico. Para esse efeito recorreu-se a métodos cromatográficos (CC, CCF, CLAP), espectrofotométricos (UV) e espectrométricos (RMN, EM). Identificaram-se assim 3-hidroxi-1,5,6-trimetoxixantona, 1,3,5-tri-hidroxi-2-metoxixantona, 1,5-di-hidroxi-3-metoxixantona, 1,6-di-hidroxi-3,5-dimetoxixantona, 1-hidroxi-3,7,8-trimetoxixantona, 1-hidroxi-3,5,6-trimetoxixantona, 1-hidroxi-3,5,6,7,8-pentametoxixantona, 1-hidroxi-3,5,6,7-tetrametoxixantona, 1,8-di-hidroxi-3,5,6,7-tetrametoxixantona e 5-formil-2,3-di-hidro-isocumarina. A 3-hidroxi-1,5,6-trimetoxixantona, a 1,3,5-tri-hidroxi-2-metoxixantona e a 1,6-di-hidroxi-3,5-dimetoxixantona foram isoladas pela primeira vez nesta espécie. A 1,6-di-hidroxi-3,5-dimetoxixantona e a 1,8-di-hidroxi-3,5,6,7-tetrametoxixantona são os compostos maioritários.

Paralelamente foi determinada a composição fenólica das infusões liofilizadas obtidas de cada uma das espécies, uma vez que é sob a forma de infusão que são habitualmente utilizadas. A infusão de Limonete é constituída essencialmente por verbascósido, tendo-se detectado, também, luteolina 7-O-diglucuronato e outros compostos não identificados. As infusões de Hipericão-do-Gerês e de Cardo-do-Coalho apresentam uma composição idêntica à do extracto metanólico respectivo. A infusão de Fel-da-Terra é composta essencialmente por derivados do ácido cinâmico; procedeu-se à hidrólise alcalina desta infusão e a análise do extracto hidrolisado revelou a presença dos ácidosp-cumárico, ferúlico e sinápico e de kaempferol.

Na segunda parte deste trabalho apresentam-se os resultados de estudos realizados no âmbito da valorização farmacológica das espécies estudadas. Atendendo ao conteúdo fenólico que estas espécies apresentam e dada a inexistência de estudos sobre a sua acção antioxidante, a actividade sequestrante das infusões obtidas de cada uma das espécies para os radicais superóxido e hidroxilo e para o ácido hipocloroso foi estudada. Para esse efeito o radical superóxido foi gerado num sistema enzimático (xantina/xantina oxidase) e num sistema químico (NADH/PMS) e a actividade sequestrante foi avaliada pela inibição da redução do azul de nitrotetrazólio. O radical hidroxilo foi gerado pelo sistema de Fenton (Fe³⁺/EDTA/ascorbato) e a actividade sequestrante foi determinada pela inibição da degradação da desoxirribose em substâncias reactivas com o ácido tiobarbitúrico; esta determinação foi também efectuada na ausência de EDTA ou de ascorbato, para avaliar, respectivamente, o potencial pró-oxidante e a capacidade para quelatar metais das infusões. A actividade sequestrante para o ácido hipocloroso foi avaliada pela inibição da oxidação do ácido 5-tio-2-nitrobenzóico.

Os resultados obtidos demonstraram que as quatro infusões são dotadas de actividade antioxidante, atribuída à sua capacidade para sequestrar radicais superóxido e hidroxilo e ácido hipocloroso e também para quelatar metais. Contudo, as infusões de Limonete e de Hipericão-do-Gerês apresentam algum potencial pró-oxidante. Ainda na vertente da actividade farmacológica foram realizados ensaios in vitro, em hepatócitos isolados de rato, e in vivo, em ratinhos, com o objectivo de tentar contribuir para o entendimento da acção hepatoprotectora atribuída ao Hipericão-do-Gerês. Nos ensaios efectuados estudou-se a actividade hepática da infusão de Hipericão-do-Gerês isoladamente e o seu papel contra a toxicidade induzida pelo terc-butil-hidroperóxido (t-BHP).

Os parâmetros avaliados nos ensaios in vitro foram a viabilidade celular, o conteúdo intracelular de glutationa reduzida (GSH) e de glutationa oxidada (GSSG) e a extensão da peroxidação lipídica.

Os parâmetros avaliados no ensaio in vivo foram os níveis plasmáticos de transaminases, o conteúdo hepático em GSH e GSSG, a extensão da peroxidação lipídica e o exame histológico de cortes de fígado.

Nos ensaios in vitro verificou-se que a incubação dos hepatócitos com infusão e t-BHP teve um efeito protector da viabilidade celular e da peroxidação lipídica. Contudo, não evitou o aumento da GSSG e a depleção da glutationa total.

No ensaio in vivo a infusão potenciou a toxicidade induzida pelo t-BHP, como foi verificado pela diminuição dos níveis de glutationa total e de GSH e pelo aumento da GSSG. Algum efeito protector foi observado a nível de peroxidação lipídica. A ingestão da infusão (100 mg/kg) provocou uma elevação dos níveis de GSSG e da razão GSSG/glutationa total.

---

Abstract

In this work four medicinal species of great consumption in Portugal were studied: Lippia citriodora, Hypericum androsaemum, Cynara cardunculus and Centaurium eryhtraea.

Although the chemical characterization of L. citriodora and C. erythraea is made, in some Pharmacopoeias, by the detection of terpenoid compounds, the aim of this work was to propose methodologies for the quality control of the four species, based on their phenolic profiles. Several extracts of each species were prepared and analysed by HPLC coupled to a diode array detector. For the establishment of the phenolic profile we propose the solvent that gave the higher number of identified compounds.

The ether extract of L. citriodora is characterized by the presence of luteolin, nepetin, hispidulin, jaceosidin, cirsimaritin, cirsilineol and eupatorin. All of the samples showed a common phenolic profile, in which hispidulin and jaceosidin are the major compounds and nepetin is the compound present in lower amount. The methanolic extract of H. androsaemum is characterized by the presence of 3- and 5-O-caffeoylquinic acids, quercetin 3-O-sulphate, quercetin 3-O-galactoside, quercetin 3-O-glucoside, quercetin 3-O-arabinoside, quercetin 3-O-rhamnoside, quercetin, kaempferol and phloroglucinol derivatives, which were not identified. On analysing the proportion among the quantified phenolics we found four distinct profiles, indicating the existence of intraspecific chemotypes. The methanolic extract of C. cardunculus is characterized by the presence of 3-, 4- and 5-O-caffeoylquinic acids, caffeic acid, 1,3-, 3,4-, 3,5-, 1,5- and 4,5-O-dicaffeoylquinic acids, luteolin 7-O-glucoside, apigenin 7-O-glucoside and luteolin, being 5-O-caffeoylquinic acid and 1,5-O-dicaffeoylquinic acid the major compounds. For C. erythraea it was necessary to proceed to the isolation and structural elucidation of the compounds present in the chloroformic extract. On this regard chromatographic (CC, TLC, HPLC), spectrophotometric (UV) and spectrometric (NMR, MS) methods were employed, which allowed the identification of 3-hydroxy-1,5,6-trimethoxyxanthone, 1,3,5-tri-hydroxy-2-methoxyxanthone, 1,5-di-hydroxy-3-methoxyxanthone, 1,6-di-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone, 1-hydroxy-3,7,8-trimethoxyxanthone, 1-hydroxy-3,5,6-trimethoxyxanthone, 1-hydroxy-3,5,6,7,8-pentamethoxyxanthone, 1-hydroxy-3,5,6,7-tetramethoxyxanthone, 1,8-di-hydroxy-3,5,6,7-tetramethoxyxanthone and 5-formyl-2,3-di-hydro-isocoumarin. 3-Hydroxy-1,5,6-trimethoxyxanthone, 1,3,5-tri-hydroxy-2-methoxyxanthone and 1,6-di-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone were isolated for the first time in this species. 1,6-di-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone and 1,8-di-hydroxy-3,5,6,7-tetramethoxyxanthone are the major compounds.

Since these species are commonly used in infusions, the phenolic composition of their lyophilized infusions was also determined. L. citriodora infusion is mainly characterized by the presence of verbascoside, despite the existence of luteolin 7-O-diglucuronide and other unidentified compounds. H. androsaemum and C. cardunculus infusions' composition was identical to the correspondent methanolic extract. C. erythraea infusion is mainly characterized by the presence of cinnamic acid derivatives; the infusion was subjected to an alkaline hydrolysis and the analysis of the hydrolyzed extract revealed the presence of p-coumaric, ferulic and sinapic acids and kaempferol.

The second part of this work presents the performed studies for the pharmacological valorization of the four species. Taking into account the phenolic content of these species and considering that nothing had been reported about their antioxidant activity, the superoxide radical, hydroxyl radical and hypochlorous acid scavenging activities of each infusion were examined. On this regard superoxide radical was generated either in an enzymatic (xanthine/xanthine oxidase) or in a chemical (NADH/PMS) systems, and scavenging ability was assessed by the inhibition of nitroblue tetrazolium reduction. Hydroxyl radical was generated by the Fe³⁺EDTA/ascorbate Fenton system, and assayed by evaluating deoxyribose degradation into thiobarbituric acid-reactive substances; this assay was also performed without EDTA or ascorbic acid, in order to evaluate, respectively, the pro-oxidant potential and the ability to chelate iron ions of the infusions. Hypochlorous acid scavenging activity was tested by measuring the inhibition of 5-thio-2-nitrobenzoic acid oxidation.

The results provided evidence that the four infusions exhibit antioxidant activity, expressed by their capacity to scavenge superoxide and hydroxyl radicals and hypochlorous acid. However, L.citriodora and H. androsaemum infusions may act as a pro-oxidants. In addition to the pharmacological activity evaluation, in vitro studies, in isolated rat hepatocytes, and in vivo studies, in mice, were performed, in an attempt to contribute for the understanding of the hepatoprotective capacity attributed to H. androsaemum. The assays examined the protective activity of H. androsaemum infusion against the toxicity induced by tert-butylhydroperoxide (t-BHP).

The parameters under evaluation for the in vitro assays were the cell viability, quantification of reduced glutathione (GSH) and oxidised glutathione (GSSG) and lipid peroxidation.

The parameters under evaluation for the in vivo assays were the plasmatic levels of transaminases, hepatic GSH and GSSG contents, hepatic lipid peroxidation and histological examination of the liver. In vitro assays showed that the simultaneous incubation of the hepatocytes with infusion and t-BHP prevented the loss in cell viability and lipid peroxidation. However, it caused an increase in GSSG and a depletion in total glutathione levels.

In vivo assays showed that the infusion potentiated the t-BHP-induced toxicity, as it was observed by the depletion in total glutathione and GSH contents and increase in GSSG levels. A protective effect was noticed against lipid peroxidation. The infusion itself (100 mg/kg) caused an increase in GSSG levels and in the GSSG/total glutathione ratio.

---

Publicações realizadas no âmbito do Doutoramento / Publications related to the study conducing PhD Degree


Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Valentão, P. ; Areias, F. Simultaneous determination of flavonoids, phenolic acids and coumarins in seven medicinal species by HPLC/DAD. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 1998, 21(18), 2813-2820.

Valentão, P. ; Andrade, P.B.; Areias, F.; Ferreres, F.; Seabra, R.M. Analysis of vervain flavonoids by HPLC/Diode-Array detector method. Its application to quality control. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4579-4582.

Valentão, P. ; Areias, F.; Amaral, J.; Andrade, P.; Seabra, R. Tetraoxygenated xanthones from Centaurium erythraea. Nat. Prod. Lett. 2000, 14 (5), 319-323.

Valentão, P. ; Fernandes, E.; Carvalho, F.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Antioxidant activity of Centaurium erythraea infusion evidenced by its superoxide radical scavenging and xanthine oxidase inhibitory activity. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3476-3479.

Valentão, P. ; Andrade, P.B.; Silva, E.; Vicente, A.; Santos, H.; Bastos, M.L.; Seabra, R.M. Methoxylated xanthones in the quality control of small centaury (Centaurium erythraea) flowering tops. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 460-463.

Valentão, P. ; Fernandes, E.; Carvalho, F.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Antioxidant activity of Hypericum androsaemum infusion: scavenging activity against superoxide radical, hydroxyl radical and hypochlorous acid. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25, 1320-1323.

Valentão, P. ; Fernandes, E.; Carvalho, F.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Studies on the antioxidant activity of Lippia citriodora infusion: scavenging effect on superoxide radical, hydroxyl radical and hypochlorous acid. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25, 1324-1327.

Valentão, P. ; Fernandes, E.; Carvalho, F.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Antioxidative properties of cardoon (Cynara cardunculus L.) infusion against superoxide radical, hydroxyl radical and hypochlorous acid. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 4989-4993.

Seabra, R.M.; Valentão, P. ; Ferreres, F.; Andrade, P.B. Phenolic profiles in the definition of natural products authenticity: cardoon versus artichoke profile. In Natural products in the new millenium: prospects and industrial applications. Rauter, A.P.; Araújo, M.F.; Palma, F.B.; Justino, J.; Santos, S.P. (Eds.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2002), 183-194.

Valentão, P. ; Dias, A.; Ferreira, M.; Silva, B.; Andrade, P.B.; Bastos, M.L.; Seabra, R. M. Variability in phenolic composition of Hypericum androsaemum. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 135-140.

Valentão, P. ; Andrade, P.B.; Silva, A.M.S.; Moreira, M.M.; Seabra, R.M. Isolation and structural elucidation of 5-formyl-2,3-dihydroisocoumarin from Centaurium erythraea aerial parts. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 361-364.

Valentão, P. ; Fernandes, E.; Carvalho, F.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Hydroxyl radical and hypochlorous acid scavenging activity of small centaury (Centaurium erythraea) infusion. A comparative study with green tea (Camellia sinensis) . Phytomed. 2003, 10, 517-522.

Valentão, P. ; Carvalho, M.; Fernandes, E.; Carvalho, F.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Protective activity of Hypericum androsaemum infusion against tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative damage in isolated rat hepatocytes. J. Ethnopharmacol. 2004, 92, 79-84.

Valentão, P. ; Carvalho, M.; Carvalho, F.; Fernandes, E.; Neves, R.P.; Pereira, M.L.; Andrade, P.B.; Seabra, R.M.; Bastos, M.L. Hypericum androsaemum infusion increases tert-butyl hydroperoxide-induced mice hepatotoxicity in vivo. J. Ethnopharmacol. 2004, 94, 345-351.

---

<--página anterior