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A identificação e enumeração rápida de patogénicos reveste-se de uma óbvia importância para a sociedade em geral. Por exemplo em microbiologia clínica, uma correcta e atempada identificação do microrganismo que infecta uma determinada pessoa pode permitir o tratamento adequado ao paciente, o que em casos limite significa garantir a sua sobrevivência. Em geral, a tecnologia correntemente aplicada baseia-se nos laboriosos, demorados e por vezes inconclusivos plaqueamentos em meio de cultura. Para se ter uma ideia, o crescimento em meio de cultura de bactérias do género Mycobacterium pode demorar até duas semanas. Outros agentes infecciosos como o Helicobacter pylori ou o Staphylococcus spp. demoram apenas dois dias, mas mesmo esse período de tempo é bastante elevado quando comparado com o que as técnicas baseadas em biologia molecular demoram a fornecer resultados (na ordem das horas). Uma das técnicas de biologia molecular mais estabelecida é a "fluorescence in situ hybridization" (FISH), que se baseia nas propriedades de hibridação do ARN ou ADN do microrganismo em questão com as sequências complementares de uma sonda (geralmente de ADN) expressamente desenhada para o efeito. No entanto problemas associados com esta técnica, nomeadamente ao nível da degradação da sonda por proteases e nucleases de células vivas ou ainda a baixa afinidade e especificidade de algumas sondas em relação às sequências que deveriam reconhecer impediram uma utilização mais alargada e comercial desta tecnologia. Recentemente, várias moléculas que mimetizam o ADN, como os ácidos péptido-nucleícos (PNA) e os "locked nucleic acids" (LNA), foram utilizadas em FISH com resultados muito promissores, havendo indicações que estes métodos podem, a curto prazo, substituir os procedimentos actualmente utilizados com benefícios quer a nível da qualidade de tratamento, quer a nível dos custos associados para o hospital uma vez que a utilização de antibióticos pode ser racional  |
Summary
A identificação e enumeração rápida de patogénicos reveste-se de uma óbvia importância para a sociedade em geral. Por exemplo em microbiologia clínica, uma correcta e atempada identificação do microrganismo que infecta uma determinada pessoa pode permitir o tratamento adequado ao paciente, o que em casos limite significa garantir a sua sobrevivência. Em geral, a tecnologia correntemente aplicada baseia-se nos laboriosos, demorados e por vezes inconclusivos plaqueamentos em meio de cultura. Para se ter uma ideia, o crescimento em meio de cultura de bactérias do género Mycobacterium pode demorar até duas semanas. Outros agentes infecciosos como o Helicobacter pylori ou o Staphylococcus spp. demoram apenas dois dias, mas mesmo esse período de tempo é bastante elevado quando comparado com o que as técnicas baseadas em biologia molecular demoram a fornecer resultados (na ordem das horas). Uma das técnicas de biologia molecular mais estabelecida é a "fluorescence in situ hybridization" (FISH), que se baseia nas propriedades de hibridação do ARN ou ADN do microrganismo em questão com as sequências complementares de uma sonda (geralmente de ADN) expressamente desenhada para o efeito. No entanto problemas associados com esta técnica, nomeadamente ao nível da degradação da sonda por proteases e nucleases de células vivas ou ainda a baixa afinidade e especificidade de algumas sondas em relação às sequências que deveriam reconhecer impediram uma utilização mais alargada e comercial desta tecnologia. Recentemente, várias moléculas que mimetizam o ADN, como os ácidos péptido-nucleícos (PNA) e os "locked nucleic acids" (LNA), foram utilizadas em FISH com resultados muito promissores, havendo indicações que estes métodos podem, a curto prazo, substituir os procedimentos actualmente utilizados com benefícios quer a nível da qualidade de tratamento, quer a nível dos custos associados para o hospital uma vez que a utilização de antibióticos pode ser racionalizada e a estadia do paciente encurtada.
O principal objectivo desta proposta é, através da combinação de grupos de investigação de diferentes áreas de especialização, o de desenvolver, avaliar e implementar métodos baseados em mímicos de ADN para a rápida detecção de microrganismos através da técnica de FISH. O sucesso deste plano de trabalhos permitirá a implementação de métodos moleculares avançados como procedimentos de rotina para a detecção de microrganismos patogénicos em ambientes clínicos, com todos os benefícios inerentes que estes métodos acarretam.
Numa primeira fase do trabalho serão desenhadas e sintetizadas as sondas necessárias para a detecção dos microrganismos de interesse. A segunda parte do trabalho debruçar-se-á sobre o desenvolvimento dos métodos para aplicação em diversos tipos de amostras (e. g. Helicobacter pylori em biopsias gástricas ou Staphylococcus epidermidis em cateteres ou amostras de sangue), utilizando para tal citometria de fluxo ou microscopia confocal. Finalmente, a eficiência dos métodos desenvolvidos será testada em amostras provenientes de ambientes clínicos tendo como comparação os meios de cultivo já existentes para cada bactéria. |